㈠ "氯喹"是一种什么药物
氯喹属于抗疟药
药物名称 氯喹
英文名称 Chloroeuine
说 明
片剂：每片含磷酸氯喹0.075g；0.25g。注射液：每支129mg（盐基80mg）（2ml）；250mg（盐基155mg）（2ml）。 复方磷酸氯喹片（复方止疟片）每片含磷酸氯喹110mg（盐基66mg）和磷酸伯氨喹8.8mg（盐基5mg）。1日1次，每次口服6片，连服3日。
功用作用 本品及其他4-氨基喹啉类抗疟药（如哌喹、氨酚喹等）主要对疟原虫的红内期起作用，可能系干扰了疟原虫裂殖体DNA的复制与转录过程或阻碍了其内吞作用，从而使虫体由于缺乏氨基酸而死亡。 本品能有效地控制疟疾症状发作。对红外期无作用，不能阻止复发，但因作用较持久，故能使复发推迟（恶性疟因无红外期，故能被根治）。对原发性红外期无效，对配子体也无直接作用，故不能作病因预防，也不能阻断传播。 目前临床发现有相当一部分恶性疟原虫对本品产生了耐药性，使本品疗效降低，因此在很多情况下需改用其它抗疟药或联合用药。 本品口服后，肠道吸收快而充分，仅8％经粪便排出。服药后1～2小时血浓度即达高峰，t1/2为48小时。能贮存于内脏组织中，可在红细胞内浓集，大部在肝内代谢，排泄较慢，故作用持久。
【应用】本品主要用于治疗疟疾急性发作，控制疟疾症状。还可用于治疗肝阿米巴病、华支睾吸虫病、肺吸虫病、结缔组织病等。另可用于治疗光敏性疾患，如日晒红斑症。
用法用量
（1）口服，控制疟疾发作，首剂1g，第2、3日各服0.5g。如与伯氨喹合用，只需第1日服本品1g。小儿首次16mg／kg（高热期酌情减量，分次服），6～8小时后及第2～3日各服8mg／kg。肌内注射，1日1次，每次2～3mg／kg，静脉滴注：临用前用5％葡萄糖注射液或0.9％氯化钠注射液500ml稀释后缓慢滴注，每次2～3mg／kg。
（2）疟疾症状抑制性预防，每周服1次，每次0.5g。小儿每周8mg／kg。
（3）抗阿米巴肝脓肿 每1、2日，每日2～3次，每次服0.5g，以后每日0.5g，连用2～3周。 （4）治疗结缔组织病 对盘形红斑狼疮及类风湿性关节炎，开始剂量1日1～2次，每次0.25g，经2～3周后，如症状得到控制，改为1日2～3次，每次量不宜超过0.25g，长期维持。对系统性红斑狼疮，用皮质激素治疗症状缓解后，可加用氯喹以减少皮质激素用量。
注意事项
（1）服药后可有食欲减退、恶心呕吐、腹泻等反应；还可出现皮肤瘙痒、紫癜、脱毛、毛发变白，湿疹和剥脱性皮炎、牛皮癣；头重、头痛、头昏、耳鸣、眩晕、倦怠、睡眠障碍、精神错乱、视野缩小、角膜及视网膜变性等。 （2）有时可见白细胞减少，如减至4000以下应停药。 （3）本品无收缩子宫作用，但可能使胎儿耳聋、脑积水、四肢缺陷，故孕妇忌用。
（4）对少数病人，可引起心律失常，严重者可致阿-斯综合征，值得重视，若不及时抢救，可能导致死亡。
（5）长期使用，可产生抗药性（多见于恶性疟）。如用量不足，恶性疟常在2～4周内复燃，且易引起抗药性。 （6）本品对角膜和视网膜有损害，因此长期服用本品治疗以前，应先作眼部详细检查，排除原有病变，60岁以上患者宜勤检查，以防视力功能损害。长期维持剂量每日以0.25g或其以下为宜，疗程不超过1年。
㈡ 氯喹的检验方法！！
色剂及显色方法
显色剂：碘化铋钾试剂
配方一：甲液 0.85g次硝酸铋溶于10mL冰乙酸中，再加水稀释至40mL 。
乙液 40%碘化钾水溶液。
临用时，取甲、乙两液各5mL，加冰乙酸20mL，水60mL，摇匀即可。
配方二：取市售碘化铋钾试剂2g，加冰乙酸20mL溶解后加50mL水稀释即可。
显色方法
经展开后的薄层板，挥尽展开剂，直接喷碘化铋钾试剂，在浅黄色背景下显橙红色斑点。
检出限：氯喹检出限2µg
5g空白检材中添加100µg氯喹标准，经提取浓缩到0.5mL，点样20µL，相当于4µg，如不出现斑点，说明回收率不好，此时如检材中未检出氯喹，不能作未检出结论，应重新操作。或者加大检材试液的点样体积，进一步证实是否有氯喹的斑点出现。
㈢ 氯喹的基本资料
药物名称：氯喹
分子式：C18H26ClN3
分子量：319.87
CAS no：54-05-7
英文名称：Chloroquine
药物说明： 片剂：每片含磷酸氯喹0.075g；0.25g。注射液：每支129mg（盐基80mg）（2ml）；250mg（盐基155mg）（2ml）。 复方磷酸氯喹片（复方止疟片）每片含磷酸氯喹110mg（盐基66mg）和磷酸伯氨喹8.8mg（盐基5mg）。1日1次，每次口服6片，连服3日。
㈣ 氯喹的体内分布有何特点其临床用途有哪些
氯喹口服后，肠道吸收快而充分，服药后l～2小时血中浓度最高。约55%的药物在血中与血浆成分结合。血药浓度维持较久，T1/2为2.5～10日。氯喹在红细胞中的浓度为血浆内浓度的10～20倍，而被疟原虫侵入的红细胞内的氯喹浓度，又比正常的高约25倍。氯喹与组织蛋白结合更多，在肝、脾、肾、肺中的浓度高于血浆浓度达200～700倍。在脑组织及脊髓组织中的浓度为血浆浓度的10～30倍。氯喹在体内的代谢转化是在肝中进行的，其主要代谢产物是去乙基氯喹，此物仍有抗疟作用。小部分（10～15%）氯喹以原形经肾排泄，其排泄速度可因尿液酸化而加快，碱化而降低。约8%随粪便排泄，氯喹也可由乳汁中排出。
用于治疗恶性疟、间日疟及三日疟。也可用于治疗肠外阿米巴病、结缔组织病、光敏感性疾病（如日晒红斑）等。本品主要本品主要用于治疗疟疾急性发作，控制疟疾症状。不能阻止复发，但因作用较持久，故能使复发推迟。也不能作疟疾的预防和阻断传播。对恶性疟疾有根治效果，但近年来发现有某些疟疾对本品产生抗药性，使疗效降低，因而需改用其他抗疟药或采用联合用药。还可用于治疗肝阿米巴病、华支睾吸虫病、肺吸虫病、结缔组织病等。另可用于治疗光敏性疾患，如日盼红斑症。
㈤ 自噬抑制剂氯喹使用方法求助
自噬抑制剂氯喹使用
自噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明，对肿瘤的研究尤其如此，值得关注。
(1)饥饿应答时的作用,在不同的器官如肝脏或在培养细胞中,氨基酸的匮乏会诱导细胞产生自体吞噬,由自体吞噬分解大分子,产生在分解代谢和合成代谢过程中所必须的中间代谢物。
(2)在细胞正常活动中的作用,如在动物的变态发育、老化和分化过程中,自体吞噬负责降解正常的蛋白以重新组建细胞。尽管通常人们认为自体吞噬不具有选择性,但是在某些病理和压力条件下,通过自体吞噬能选择性地隔离某些细胞器,如线粒体、过氧化物酶体等。
(3)在某些组织中的特定功能,如黑质的塞梅林神经节中,多巴胺能神经元中的神经黑色素的合成就需要把细胞质中的多巴胺醌用AV包被隔离起来。
㈥ 氯喹是激素药吗 有何作用
氯喹 Chloroquine不是激素药，是抗疟药。 但是与激素药合用，可减少激素用量，减低激素的某些不良反应。
氯喹适应症
本品主要用于治疗疟疾急性发作，控制疟疾症状。不能阻止复发，但因作用较持久，故能使复发推迟。也不能作疟疾的预防和阻断传播。对恶性疟疾有根治效果，但近年来发现有某些疟疾对本品产生抗药性，使疗效降低，因而需改用其他抗疟药或采用联合用药。还可用于治疗肝阿米巴病、华支睾吸虫病、肺吸虫病、结缔组织病等。另可用于治疗光敏性疾患，如日盼红斑症。
用量用法
1.治疗疟疾：口服先服1g，8小时后再服0．5g，第2、3日各服0．5g，全疗程3日。如与伯氨喹合用，只需第1日服本品1g。小儿首次每千克体重16mg（高热期酌情减量，分次服），6～8小时后及第2～3日每千克体重各服8mg。肌内注射：每次每千克体重2～3mg，1日1次。静脉滴注：临用前用5％葡萄糖注射液或等渗盐水500ml稀释后缓慢滴注，每次每千克体重2～3mg。 2.抑制性预防疟疾：每周服1次，每次0．5g即可。小儿每周每千克体重8mg。 3.抗阿米巴肝炎或肝脓肿：第1、2日，每次服0．5g，每日2次，连用12～19日。 4.治疗结缔组织病：对盘形红斑狼疮及类风湿性关节炎，开始剂量每次0．25g，1日1～2次，经2～3周后，如症状得到控制，改为1日2～3次，每次量不宜超过0．25g，长期维持。对系统性红斑狼疮，用皮质激素治疗症状缓解后，可加用氯喹以减少皮质激素用量。
注意事项
1.服药后可有食欲减退、恶心、呕吐、腹泻等不良反应；还可出现皮肤瘙痒、紫癜、脱毛、毛发变白、湿疹和剥脱性皮炎、牛皮癣；头重、头痛、头昏、耳鸣、眩晕、倦怠、睡眠障碍、精神错乱、视野缩小、角膜及视网膜变性等症状。 2.有时可有白细胞减少，如减至4000以下应停药。 3.本品无收缩子宫作用，但可能使胎儿耳聋、脑积水、四肢缺陷，故孕妇忌用。 4.对少数病人，可引起心律失常，严重者可致阿斯综合征，值得重视。若不及时抢救，可能导致死亡。 5.长期使用可产生抗药性（多见于恶性疟）。如用量不足，恶性疟常在2～4周内复燃，且易引起抗药性。 6.本品对角膜和视网膜有损害，故在长期服用本品治疗以前，应先作眼部详细检查，排除原有病变，60岁以上病人宜勤检查，以防视力功能损害。长期维持剂量每日以0．25g或其以下为宜，疗程不超过1年。 7.与伯氨喹合用时，部分病人可产生严重心血管系统不良反应，如改为序贯服用，效不减而不良反应降低。 8.与氯丙嗪等对肝有损害的药物合用，可加重肝脏负担；与保泰松合用易引起过敏性皮炎；与氯化铵合用可加速排泄而降低血药浓度；必须注意
储存、有效期
[制剂] 片剂：每片含磷酸氯喹0．25g（盐基0．15g）。 注射液：每支129mg（盐基80mg）
㈦ 自噬抑制剂氯喹使用方法求助
5mM浓度使用浓度3-MA简单溶解：0.015g溶于10ml培养基37度培养箱放置2即能溶解；般现配现用溶液状态4度放置月
㈧ 抗疟疾药物的使用原则
抗疟疾药物是防治疟疾的重要手段。现有抗疟药中尚无一种能对疟原虫生活史的各个环节都有杀灭作用，那你知道抗疟疾药物的使用原则是什么吗?下面是我为你整理的抗疟疾药物的使用原则的相关内容，希望对你有用!
抗疟疾药物的使用原则
抗疟药的使用应遵循安全、有效、合理和规范的原则。根据流行地区的疟原虫虫种及其对抗疟药物的敏感性和患者的临床表现，合理选择药物，严格掌握剂量、疗程和给药途径，以保证治疗效果和延缓抗药性的产生。
(一)间日疟治疗药物
首选磷酸氯喹片(简称氯喹)、磷酸伯氨喹片(简称伯氨喹)。治疗无效时，可选用以青蒿素类药物为基础的复方或联合 用药 的口服剂型进行治疗。
(二)恶性疟治疗药物
以青蒿素类药物为基础的复方或联合用药(ACT)，包括：青蒿琥酯片加阿莫地喹片、双氢青蒿素哌喹片、复方磷酸萘酚喹片、复方青蒿素片等。
(三)重症疟疾治疗药物
1. 青蒿素类药物注射剂，包括蒿甲醚和青蒿琥酯。
2. 磷酸咯萘啶注射剂。
二、用药方案
(一)间日疟的治疗
氯喹加伯氨喹：氯喹口服总剂量1200mg。第1 日600mg 顿服，或分2 次服，每次300mg;第2、3 日各服1 次，每次300mg。伯氨喹口服总剂量180mg。从服用氯喹的第1 日起，同时服用伯氨喹，每日1次，每次22.5mg，连服8 日。此疗法也可用于卵形疟和三日疟的治疗。
(二)恶性疟的治疗(选用以下一种方案)
1. 青蒿琥酯片加阿莫地喹片：口服总剂量青蒿琥酯和阿莫地喹各12 片(青蒿琥酯每片50mg，阿莫地喹每片150mg)，每日顿服青蒿琥酯片和阿莫地喹片各4 片，连服3 日。
2. 双氢青蒿素哌喹片：口服总剂量8 片(每片含双氢青蒿素40mg，磷酸哌喹320mg)，首剂2 片，首剂后6—8 小时、24 小时、32 小时各服2 片。
3. 复方磷酸萘酚喹片：口服总剂量8 片(每片含萘酚喹50mg，青蒿素125mg)，一次服用。
4. 复方青蒿素片：口服总剂量4 片(每片含青蒿素62.5mg，哌喹375mg)，首剂2 片，24 小时后再服2 片。
(三)重症疟疾的治疗(选用以下一种方案)。
1.蒿甲醚注射剂：肌注每日1 次，每次80mg，连续7 日，首剂加倍。若病情严重时，首剂给药后4—6 小时可再肌注80mg。
2.青蒿琥酯注射剂:静脉注射每日1 次，每次60mg，连续7 日，首剂加倍。若病情严重时，首剂给药后4—6 小时，可再静脉注射60mg。采用上述两种注射疗法治疗，患者病情缓解并且能够进食后，改用ACT 口服剂型，再进行一个疗程治疗。
3.咯萘啶注射剂:肌注或静脉滴注，总剂量均为480mg。每日1次，每次160mg，连续3 日。需加大剂量时，总剂量不得超过640mg。
(四)孕妇疟疾治疗
孕妇患间日疟可采用氯喹治疗。 孕期 3 个月以内的恶性疟患者可选用磷酸哌喹，孕期3 个月以上的恶性疟患者采用ACT 治疗。孕妇患重症疟疾应选用蒿甲醚或青蒿琥酯注射剂治疗。
(五)间日疟休止期根治
伯氨喹：口服总剂量180mg，每日1 次，每次22.5mg，连服8 日。
(六)预防服药(选用以下一种方案)。
1.磷酸哌喹片：每月1 次，每次服600mg，睡前服。
2.氯喹：每7—10 天服1 次，每次服300mg。
注：
①氯喹、磷酸哌喹、伯氨喹和咯萘啶的剂量均以基质计。
②方案中剂量均为成人剂量， 儿童 剂量按体重或年龄递减。
③地喹可引起粒细胞缺乏，萘酚喹可引起血尿, 服用时如出现副反应，应立即停药。
④使用青蒿琥酯注射剂做静脉注射时，需先将5%碳酸氢钠注射液1ml 注入青蒿琥酯粉剂中，反复振摇2—3 分钟，待溶解澄清后，再注入5ml 等渗葡萄糖或生理盐水，混匀后缓慢静脉推注(不宜滴注)。配制后的溶液如发生混浊，则不能使用。
⑤使用咯萘啶注射剂做静脉滴注时，需将160mg 咯萘啶药液注入500ml 等渗葡萄糖或生理盐水中，静脉滴注速度不超过60 滴/分。
⑥磷酸哌喹有肝脏积蓄作用，采用磷酸哌喹片进行预防服药时，连续服药时间不宜超过4 个月(需要时，应停药2—3 个月后再次进行预防服药)。
⑦孕妇、1 岁以下婴儿、有 溶血 史者或其家属中有溶血史者应禁用伯氨喹;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏地区的人群，应在医务人员的监护下服用伯氨喹。
抗疟疾药物的药品分类
控制症状
1.氯喹(choroguine)：
人工合成的4-氨喹啉类衍 生物
(1)对各种疟原虫的红细胞内期裂殖体有杀灭作用，可迅速控制症状。也可用于症状抑制性预防。其特点是疗效高，生效快。对红细胞外期无效。因其影响DNA复制和RNA转录并致氨基酸缺乏而抑制疟原虫的分裂繁殖。
(2)抗肠道外阿米巴病。
(3)抑制免疫反应，用于类 风湿 性 关节炎 ，蝶形 红斑狼疮 等。常规剂量不良反应少且轻微，大剂量可引起视力障碍及肝肾损害。
2.奎宁(Quinine)：
对各种疟原虫的红细胞内期滋养体有杀灭作用，能控制临床症状。不良反应有金鸡纳反应，心肌抑制作用，特异质反应，子宫兴奋作用和中枢抑制作用。主要用于耐氯喹或耐多药的恶性疟，尤其是脑型疟疾的救治。
3.青蒿素(Artemisinin)和蒿甲醚(Artemether)：
青蒿素的过氧基团可产生自由基，对红细胞内期滋养体有杀灭作用，用于治疗间日疟、恶性疟，对脑型疟和耐氯喹虫株感染仍有良好疗效。但最大缺点是复发率高。不良反应少见。但大剂量对 动物 胚胎有毒性作用，孕妇禁用。蒿甲醚抗疟活性比青蒿素强，近期复发率较低，不良反应较轻。
4.木芴醇系甲氟喹类：
对间日疟、恶性疟有效，杀虫彻底、作用持久，但控制症状慢，与蒿甲醚配伍。
控制复发
伯氨喹(Primaquine)
主要对间日疟继发性红细胞外期和各种疟原虫的配子体有较强的杀灭作用，是根治间日疟和控制疟疾传播的最有效的药物。此药毒性大，6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症的患者易发生急性溶血性 贫血 和高铁血红蛋白血症。
病因性预防
乙胺嘧啶(Pyrimethamine)
对恶性疟和间日疟的原发性红细胞外期有抑制作用，是病因性预防的首选药;又能阻止疟原虫在蚊体内的孢子增殖，起控制传播的作用;还抑制对红细胞内期的未成熟裂殖体，用于控制耐氯喹的恶性疟症状发作，但生效较慢。抑制疟原虫的二氢叶酸还原酶，阻碍核酸的合成。常与二氢叶酸合成酶抑制剂磺胺类或砜类合用以增强疗效，用于耐氯喹的恶性疟。不良反应少，大剂量可引起巨幼红细胞性贫血。儿童误服可引起惊厥、死亡。
抗疟疾药物的体内阶段
1.原发性红外期
受疟原虫感染的按蚊叮咬者，孢子体随其唾液注入人体 血液 ，侵入实质细胞，进行裂殖，经6～12日成熟，形成大量裂殖子，逸出肝细胞并进入红细胞。此期发生在进入红细胞之前，并不发生临床症状，是疟疾的潜伏期。应用对此期有效的药物，如乙氨嘧啶等即有预防作用。
2.继发性红外期
一部分孢子进入肝细胞后缓慢或暂不发育，称休眠体。休眠体经4～6个月后陆续增殖分裂，成为继发性红外期，是疟疾复发的根源。已知恶性疟原虫和三日疟原虫无此期，用氯喹、奎宁等治疗后不再复发;间日疟原虫及蛋形疟原虫有此期，因此常出现复发。伯氨喹、扑疟隆等药能作用于此期，故将它们与氯喹配合应用，可以根治间日疟。
3.红内期
进入红细胞的裂殖子发育成滋荞体，再变为裂殖体，最后裂殖体成熟释放出大量裂殖子而重新侵入其他红细胞，重复其裂殖增殖。大量裂殖子逸出红细胞时引起疟疾症状发作。能杀灭裂殖体的药物如氯喹、奎宁，可以控制疟疾症状。
红细胞内的裂殖增殖，经3～5代后，由于人体内情况对裂殖子增殖不利，于是部分红细胞内的裂殖子分化为雌雄配子体。当按蚊吸血时，它们即进入蚊体进行有性生殖，最后形成孢子体而引起传播与流行。由于配子体是疟疾流行、传播的根源，因此应用杀灭或抑制配子体的药物，如扑疟喹、伯氨喹、乙氨嘧啶等，可以防止疟疾传播。
近年来，中、南美洲及东南亚地区相继出现具有抗药性的疟原虫株，其中恶性疟原虫抗氯喹株的增多使问题更为严重。疟原虫对氯喹、乙胺嘧啶比较容易产生抗药性，其次是奎宁和伯喹。实验结果表明，耐乙胺嘧啶的疟原虫，其二氢叶酸还原酶大量增加或与乙胺嘧啶的结合力明显降低，使乙胺嘧啶对疟原虫的抑制作用明显减弱。为防止抗药性现象的产生，临床现提倡联合用药，即联用不同作用点的抗疟药，使疟原虫的不同代谢环节受到药物的干扰。例如联用乙胺嘧啶(或甲氧苄氨嘧啶)和磺胺类(或砜类如氨苯砜)，前者抑制二氢叶酸还原酶，后者抑制二氢叶酸合成酶，两者合用，对疟原虫的叶酸代谢产生双重阻断作用，因而使其核酸合成受抑制，细胞核不能分裂繁殖。
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㈨ 细胞自噬
自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。 这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。
在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上， 自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。 此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。
自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等
1、自噬相关试剂的使用。
①MDC: 取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;
②Rapamycin: 用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;
400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;
③3-MA: 首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；
用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主
④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h
sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些
⑤无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。
⑥Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存
不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。
⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。
1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；
2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。
2、自噬诱导剂
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin：mTOR抑制剂
(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
3、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。
3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。
氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。
雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;
4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡
单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:
(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;
(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1 nM的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;
(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;
(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。
5、流式细胞术检测细胞自噬发生率
(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;
(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;
(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;
(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;
(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000 rpm.离心5 min;
(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;
(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;
(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5 min;
(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;
(10)重复步骤(6)和(7);
(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞
仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。
LC3B WB: 1:2000
条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA 湿转45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可
LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min
转自科研者言公众号
基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用
㈩ 氯喹的用法用量
（1）口服，控制疟疾发作，首剂1g，第2、3日各服0.5g。如与伯氨喹合用，只需第1日服本品1g。小儿首次16mg/kg（高热期酌情减量，分次服），6～8小时后及第2～3日各服8mg/kg。肌内注射，1日1次，每次2～3mg/kg，静脉滴注：临用前用5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液500ml稀释后缓慢滴注，每次2～3mg/kg。
（2）疟疾症状抑制性预防，每周服1次，每次0.5g。小儿每周8mg/kg。
（3）抗阿米巴肝脓肿每1、2日，每日2～3次，每次服0.5g，以后每日0.5g，连用2～3周。
（4）治疗结缔组织病对盘形红斑狼疮及类风湿性关节炎，开始剂量1日1～2次，每次0.25g，经2～3周后，如症状得到控制，改为1日2～3次，每次量不宜超过0.25g，长期维持。对系统性红斑狼疮，用皮质激素治疗症状缓解后，可加用氯喹以减少皮质激素用量。