A. 请问细胞裂解液如何配制, 细胞裂解之后有粘滞的团块形成,要如何避免啊
博凌科为生物科技-为你一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1...
B. 蛋白酶抑制剂的生化试剂
破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。
PMSF
1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);
2）10mg/ml溶于异丙醇中；
3）在室温下可保存一年；
4）工作浓度：17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);
5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。EDTA
1）抑制金属蛋白水解酶；
2）0.5mol/L水溶液，pH8~9;
3）溶液在4℃稳定六个月以上；
4）工作浓度：0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);
5）加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。
胃蛋白酶抑制剂（pepstantin)
l）抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶；
2）1mg/ml溶于甲醇中；
3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月；
4）1作浓度：0.7ug/ml（1umol/L)
5）在水中不溶解。
亮抑蛋白酶肽（leupeptin)
1）抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B;
2）lOmg/ml溶于水；
3）储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月；
4）工作浓度0.5ug/ml。
胰蛋白酶抑制剂（aprotinin)
1）抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；
2）lOmg/ml溶于水，pH7~8
3}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月；
4）工作浓度：0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L);
5）避免反复冻融：
6）在pH>12.8时失活。
蛋白酶抑制剂混合使用
35ug/ml PMSF………………………丝氨酸蛋白酶抑制剂
0.3mg/ml EDTA……………………金属蛋白酶抑制剂
0.7ug/ml胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）…………酸性蛋白酶抑制剂
0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin）…………广谱蛋白酶抑制剂
C. 请教胰酶使用注意及贴壁细胞的消化
博凌科为生物科技-为你解答：胰酶使用注意：1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。贴壁细胞的消化：1、吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清2、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）3、显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接，使组织或细胞片分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。加入胰蛋白酶-EDTA溶液，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫 状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作。（消化过头，可造成大量 细胞从瓶壁上脱下，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，所以加入完全培养基可以终止反应。胰酶配置方法：1、培养液配制，方便好用，对细胞影响小，并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制，要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时，调pH 7.8-8.0，过滤除菌。）3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g，先用少许灭菌过的PBS调成糊状，然后补足到100ml。置室温搅拌4小时或冰箱内过 夜，过滤灭菌，分装，4℃保存备用。）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；2.次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。）一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌，至于作用效果，需要消化一次细胞感觉一下，因为不同厂家的酶不一样，有的作用温和，有的作用剧烈。4、是否需要四度放置过夜，取决于你的胰酶的纯度。过去的胰酶纯度不高，所以难以溶解，需要四度过夜. 而现在的胰酶纯度都很高，就没有必要四度过夜。从理论上来说，四度放置过夜，给细菌生长的机会，尽管过滤可以出去细菌，可是出不掉其代谢产物。胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因，考虑有：1、过期或是酶已经部分变性2、溶液ph值不对3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象，因胰酶多取自动物胰腺，沉淀为组织块，过滤后即可
D. 蛋白酶抑制剂的概述
蛋白酶是人类免疫缺陷病毒基因编码中的一种特异天冬酰蛋白酶，其作用是将基因和基因表达所产生的蛋白裂解，成为具有活性的病毒结构蛋白和酶，是HⅣ病毒复制的关键物质。蛋白酶抑制剂是一种治疗艾滋病的化学同类药物。
蛋白酶抑制剂属多肽类化合物，为抗HⅣ药物复合疗法重要组成部分，是90年代中后期的新产品，药物合成工艺难度大，也是导致目前抗HⅣ治疗费用居高不下的主要原因，被称为必须跨越壁垒。蛋白酶抑制剂主要有：奈非那韦、沙奎邦韦、茚地那韦、安泼那韦、利托那韦、洛匹那韦及复合制剂。
E. 细胞蛋白质提取液（PBS，PMSF，蛋白酶抑制剂）各需要加多少呢
6孔板加150-250ul裂解液（含1mM PMSF），PMSF是蛋白酶抑制剂，与裂解液配比1:100
F. 提DNA用的1%SDS-PK（蛋白酶K）如何配置
50MMOL/L TRIS-CL（PH8.0）和1.5MMOL/L乙酸钙,高压灭菌后,该混合溶液配制成含蛋白酶K浓度为20MG/ML的溶液,将配制的蛋白酶K溶液-20度保存.
G. 0.1%链酶蛋白酶怎样配置，用来做细胞培养，多谢！
一般的做法是这样的：
把该酶的粉末溶解于含有10mmol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，
配成为0.1%浓度，于37℃温育1h。
分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。
这样的链酶蛋白酶实际上是自消化过的，可以去掉其他杂质。
H. roche蛋白酶抑制剂如何使用，直接用水配加到裂解液中吗
理论上要加的！这点是肯定的 实际上“蛋白酶抑制剂”都是剧毒品，不容易购买，不容易保管。所以我一般不加。 问题来了，“怎么减少蛋白分解的误差呢？” 我的做法是，将“目标组”和“对照组”在一样的条件下，一样的实验点，一样的时间点检测。
I. 木瓜蛋白酶的作用，用法，用量，适用范围是什么
木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜 木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。 存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。木瓜蛋白酶在各个行业的应用1.医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫 、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 2.食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸。用于水解动植物蛋白、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有利于人体的消化和吸收。 3.美容化妆品工业应用： 将木瓜蛋白酶加入到含有蛋白质和油脂的化妆品中，具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高产品档次。可制成减肥茶、美容护肤品等。 4.日化品工业应用： 用于香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等，去污力强，除菌消毒、安全放心。 5.饲料工业应用： 用于饲料添加剂，开发蛋白源，利于吸收，提高饲料的利用率，节约成本，有助于牲畜消化，加速生长。如在猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鱼、虾等饲料中添加。还可以作为蔬菜水果高级复合肥料的添加剂。 6.皮革工业应用： 利用木瓜蛋白酶制成脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮效果。 纺织工业应用：可用于处理羊毛、蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、抗收缩、抗张强度等效果。 7.细胞培养： 木瓜蛋白酶在准备细胞培养液（cell culture）的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用Pasteur pipette将组织块打散为单细胞悬浮液。 8. 免疫学： 在免疫学中，木瓜蛋白酶可被用于将免疫球蛋白（即抗体）的Fc片段（可结晶）和Fab片段（抗原结合）切割开。
J. 透析时为了防止蛋白降解，一般加什么蛋白酶抑制剂呀或者有什么相关的建议。谢谢！
现在如果为了获得最广谱的抑制效果，就买抑制剂的cocktail，是将多种类型的抑制剂混合在一起，以达到最佳的抑制效果。有片剂的（Roche的用的最多）溶到溶液里面就能用，或者是直接是高浓度溶液包装的（Pierce的用的比较多），直接加到溶液里面就用，可以用多少加多少，比较方便。当然，也有不加蛋白酶抑制剂的，就需要一直维持在低温条件下进行透析。不过降解是一方面，也需要观察透析过程中是否有蛋白由于长时间透析可能会出现蛋白沉淀的问题。