⑴ 如何选择二抗
1 一抗的物种来源\x0d2 一抗是属于哪个类或亚类\x0d二抗需与一抗的类别或亚类相匹配.这通常是针对单克隆抗体而言.多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体.\x0d单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗体.\x0d如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3）,那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合.\x0d如果你不知道一抗是哪一类别或亚类,那么抗小鼠IgG是一个不错的选择,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白.\x0d下面总结了几种具有不同特异性的二抗：\x0d针对整个抗体分子（H＋L）具有特异性：如anti-IgG(H+L),此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合,即与抗体分子的 Fc,F(ab’)2/Fab部分（见图5）均可反应,anti-IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应（如IgM和IgA）,因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链（?链或?链）.\x0d针对Fab片段具有特异性：这类抗体与重链轻链均可以结合,由于它们可以与轻链反应,它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应.\x0d这对Fc片段或重链具有特异性：这类抗体和重链的Fc部分反应,一次它们是类别特异性的（即gamma链特异性抗体只与IgG反应,mu链特异性抗体只识别IgM,依此类推）.\x0d轻链（lambda,kappa）特异性：与所有类别的抗体反应,因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链.\x0d经过吸附处理的二抗：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应,一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理,以减少非特异性背景.例如,如果是小鼠的组织或细胞,那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合.但是此种抗体识别表位的数量被大大减少.\x0d整个IgG分子：此种抗体适用于多数情况.\x0dF(ab’)2片段：该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成,这些抗体用在特定的情况中,如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况.\x0dFab片段：它们只有一个结合位点,一般用来封闭内源性免疫球蛋白.\x0d一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP）,荧光基团（FITC,RRX,TR,PE）和生物素.选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验.对于western blot和ELISA,最常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗.如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统.5 抗体的纯度：
⑵ 荧光二抗用什么稀释PBS,蒸馏水
抗体不用水稀释，一般用PBS稀释，稀释后马上就用，尽量不要存放。如果背景有些高，可以用PBS－T稀释也行。
⑶ 荧光二抗594怎么选择激发光
DyLight 594（A23430）荧光二抗，兔抗山羊，该抗体与山羊IgG全分子反应。它也与山羊IgG的重链，以及山羊其它免疫球蛋白的轻链发生反应。它对非免疫球蛋白的血清蛋白没有反应性。但它可能与其它物种的免疫球蛋白有潜在的交叉反应，DyLight 594标记的抗体荧光亮度明显强于Alexa 594标记抗体，在可见光谱的深红色区域内DyLight 594标记二抗是所有免疫荧光实验中最好的选择。另外DyLight荧光标记的二抗比传统的FITC/Cy2以及Alexa 488具有更高的性价比。
⑷ 免疫荧光步骤 一抗 二抗 怎么稀释
二抗能起到信号放大的作用，如果仅仅依赖一抗，可能抗体需要量以及光亮强度都会受局限。
即，一抗负责准确识别靶标分子，二抗负责信号放大。典型实验结果如下图：
⑸ 免疫组化中，一抗、二抗的制备方法原理
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理
ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤
方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔
中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，
37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
Na�CO3 1.59克
NaHCO3 2.93克
加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO4·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.05％ 0.5ml
加蒸馏水至1000ml
(3) 稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
加洗涤缓冲液至100ml
或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：
蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):
0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml
0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml
加蒸馏水50ml。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:
TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml
底物缓冲液(PH5.5) 10ml
0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:
ABTS 0.5mg
底物缓冲液(PH5.5) 1ml
3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。
(四) 注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
⑹ 免疫荧光的一抗核二抗分别用什么稀释
PBS稀释。当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。上网查一下，有很多protocol。一般一比几百到一万都有，依抗体而定。可以4度过夜，这样染色效果好。
二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。
(6)荧光二抗粉末如何配置扩展阅读：
注意事项：
为进一步提高信噪比，推荐配套使用QuickBlock™免疫染色封闭液(P0260)和QuickBlock™免 疫染色一抗稀释液(P0262)用于封闭及一抗的稀释。
为了能使稀释的二抗可以反复多次使用，二抗孵育结束后稀释的二抗应立即存放在4℃，以便于后续重复使用。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品， 不得存放于普通住宅内。
为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。