❶ 質粒的分離操作
從細菌中分離質粒 DNA 的具體操作 一、材料
含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管（又稱eppendorf管），離心管架。
二、設備
微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速離心機，恆溫振盪搖床，高壓蒸汽消毒器（滅菌鍋），渦旋振盪器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恆溫水浴鍋等。
三、試劑
1、LB液體培養基（Luria-Bertani）：稱取蛋白腖（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶於800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鍾。
2、LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。
3、氨苄青黴素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存備用。
4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配製成10mg/ml，並分裝成小份（如1.5ml）保存於-20℃，每一小份一經使用後便予丟棄。
5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸調pH至5.2，加水定容至100ml，分裝後高壓滅菌，儲存於4℃冰箱。
6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配製，每瓶100ml，高壓滅菌15分鍾，儲存於4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1%SDS。
8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，並高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
9、RNA酶A母液：將RNA酶A溶於10mmol/LTris·Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml
的溶液，於100℃加熱15分鍾，使混有的DNA酶失活。冷卻後用1.5mleppendorf管分裝成小份保存於-20℃。
10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA和DNA的交聯，應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羥基喹啉（作為抗氧化劑），並用等體積的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris·Cl（pH8.0）緩沖液反復抽提使之飽和並使其pH值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配於有機相。
11、氯仿：按氯仿：異戊醇=24：1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性並有助於液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積/體積=1：1混合上述飽和酚與氯仿即
得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。
12、TE緩沖液：10mmo/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高壓滅菌後儲存於4℃冰箱中。
13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。
14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。
15、電泳所用試劑：⑴TBE緩沖液（5×）：稱取Tris54g，硼酸27.5g，並加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。⑵上樣緩沖液（6×）：0.25%溴酚藍，40%（w/v）蔗糖水溶液。 一、細菌的培養和收集
將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基（含50μg/mlAmp）中，37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養基（含50μg/mlAmp）中，37℃振盪培養約12小時至對數生長後期。
二、質粒DNA少量快速提取
質粒DNA小量提取法對於從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
（一）、煮沸法
1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000轉離心30秒。
2、棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。
3、將菌體沉澱懸浮於120mlSTET溶液中，渦旋混勻。
4、加入10ml新配製的溶菌酶溶液（10mg/ml），渦旋振盪3秒鍾。
5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。
6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鍾。
7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
8、取20ml進行電泳檢查。
[注意]1.對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的質粒DNA中會含有RNA，但RNA並不幹擾進一步實驗，如限制性內切酶消化，亞克隆及連接反應等。
（二）、鹼法
1、取1.5ml培養液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。
2、棄上清，將管倒置於衛生紙上數分鍾，使液體流盡。
3、菌體沉澱重懸浮於100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振盪），室溫下放置5-10分鍾。
4、加入新配製的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次，以混勻內容物（千萬不要振盪），冰浴5分鍾。
5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，並倒置離心管，溫和振盪10秒，使沉澱混勻，冰浴中5-10分鍾，4℃下12000g離心5-10分鍾。
6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿（1:1），振盪混勻，4℃下12000g離心5分鍾。
7、將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振盪混勻後置於-20℃冰箱中20分鍾，然後4℃下12000g離心10分鍾。
8、棄上清，將管口敞開倒置於衛生紙上使所有液體流出，加入1ml70%乙醇洗沉澱一次，4℃下12000g離心5-10分鍾。
9、吸除上清液，將管倒置於衛生紙上使液體流盡，真空乾燥10分鍾或室溫乾燥。
10、將沉澱溶於20μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲於-20℃冰箱中。
[注意]1.提取過程應盡量保持低溫。2.提取質粒DNA過程中除去蛋白很重要，採用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。3.沉澱DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉澱完全。沉澱DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉澱完全，速度快，但常把鹽沉澱下來，所以多數還是用乙醇。
（三）、Wizard少量DNA純化系統
Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒DNA，整個過程只需15分鍾。提取的質粒可直接用於DNA測序、酶切分析和體外轉錄等。該系統中所含試劑和柱子可以用於50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml過夜培養細胞液4℃下12000g離心1-2分鍾。
2、去除上清液，菌體細胞懸浮於200μl細胞懸浮液中，充分混合，並移入eppendorf管中。
3、加200μl細胞裂解液，顛倒離心管數次，直到溶液變清亮。
4、加200μl中和液，顛倒離心管數次。
5、4℃下12000g離心5分鍾，取上清液於新的eppendorf管中。
6、加1mlWizard少量DNA純化樹脂，顛倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器，取出注塞，並使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，並用注塞輕推，使混合物進入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入2ml柱洗液，並用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置於eppendorf管中，離心2分鍾以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μlTE（或水）於微型柱中，靜止1分鍾後，4℃下12000g離心20秒。
11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯於4℃或-20℃冰箱。
[注意]樹脂使用前應充分混勻，如有結晶，可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鍾。
三、質粒DNA的大量提取和純化
在製作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA，為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、鹼法
1、取培養至對數生長後期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鍾，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。
2、將細菌沉澱重新懸浮於50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
4、將細菌沉澱物重新懸浮於5ml溶液I中，充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml新配製的溶液Ⅱ，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數次，以充分混勻內容物，冰浴10分鍾。6、加9ml用冰預冷的溶液Ⅲ，搖動離心管數次以混勻內容物，冰上放置15分鍾，此時應形成白色絮狀沉澱。
7、4℃下5000g離心15分鍾。
8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37℃水浴20分鍾。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振盪混勻，4℃下12000g離心10分鍾。
10、取上層水相，加入等體積氯仿，振盪混勻，4℃下12000g離心10分鍾。
11、取上層水相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分鍾。
12、4℃下12000g離心15分鍾，沉澱用數ml70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鍾。
13、真空抽干沉澱，溶於500mlTE或水中。
[注意]1.提取過程中應盡量保持低溫。2.加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ後操作應混和，切忌劇烈振盪。3.由於RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應先對該酶液進行熱處理（80℃1小時），使DNA酶失活。
（二）、Wazard大量DNA純化系統
鹼法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統既簡單又快速，只需要離心和真空抽干，這個系統可以從500ml培養液中在3小時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA（200-20000bp）。該系統不需要酚和氯仿抽提，純化後的DNA溶於水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用於DNA序列分析和酶切反應，也可以用於在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。該系統中含有的試劑和柱子可以用於10次100-500ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括：150ml細胞懸浮液，150ml細胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA純化樹脂，125mlWizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管的柱子。
1、100-500ml細胞培養液置離心管中，22-25℃下5000g離心10分鍾，所得細胞沉澱充分懸浮於細胞懸浮液中。
2、加15ml細胞裂解溶液並輕輕混合，可以反復倒置混合，但不能用渦旋振盪，細胞裂解完全時，溶液會變清，這一步需要20分鍾。
3、加15ml中和溶液，立即反復倒置離心管數次，並使之混勻。
4、14000g，22-25℃離心15分鍾。
5、小心地將上清液吸出並移至一個新離心管中。
6、加0.5倍體積的異丙醇，混合均勻，14000g22-25℃下離心15分鍾。
7、棄上清，懸浮DNA沉澱於2mlTE緩沖液中。這一步中也許有的沉澱不能溶解。
8、加10mlWizard大量DNA純化樹脂溶液，並渦旋混合。
9、每一個樣品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的頭插在真空器上（Promega產品，與此配套）。
10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中，真空抽取樹脂/DNA混合液。
11、將樹脂/DNA混合液抽干後，加13ml柱子洗脫溶液至離心管中，對管底部的樹脂/DNA進行洗脫（柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液），並加入柱子中。
12、真空抽干所加入的洗脫。
13、再加12ml柱子洗脫液進柱子並抽干。
14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的樹脂，柱子真空抽干後將柱子放入用戶提供的離心管
中，2500rpm（1300g）離心5分鍾。
15、取出柱子，真空抽干5分鍾，再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm（1300g）離心5分鍾。
16、在柱子中加入1.5ml65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE，1分鍾後2500rpm（1300g）離心柱子/離心管5分鍾。
17、取出柱子，離心管中溶液即為提取的質粒DNA，可以直接放在離心管中，蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
[注意]1.在使用之前，系統所提供的柱子洗脫液按1：1加入125ml95%乙醇。2.純化樹脂必須混勻後再用.
（三）、Sephrose2B柱純化質粒DNA
鹼法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理，仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA製品時，則需進行進一步純化。一般常用Sepharose2B或Sepharose4B進行純化，該方法具有快速，條件溫和，重復性好，載體物質可以再利用等優點，因而已廣泛用於質粒DNA純化。
1、將Sepharose2B經含0.1%SDS的TE（pH8.0）平衡後上柱。
2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase2B柱上。
3、待DNA溶液完全進入柱內後立即在柱的上部連接含有0.1%SDS的TE（pH8.0）貯液瓶。
4、以1ml流出液為1份進行收集。
5、對每一管測定其OD260值，以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
6、合並所有含質粒的洗脫液，用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提，4℃下12000g離心2分鍾，將上層水相轉入新管。
7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉澱10分鍾，然後4℃下12000g離心10分鍾，棄去上清液。
8、沉澱加70%乙醇洗滌，4℃下12000g離心10分鍾，棄去上清液。
9、沉澱真空抽干，重新溶於TE或無菌水中。
[注意]在裝柱過程中，要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象，要使界面保持平整。對新裝成的柱，應用含0.1%SDS的TE平衡，以使柱內的凝膠均勻。
❷ 如何去除噬菌體載體中間片段 左臂 右臂 去除
如何將PCR片段轉移到載體多克隆位點之間
重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。
DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。 T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然後，酶-ATP復合物再結合到具有5』磷酸基和3』羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最後產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。
很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA每條鏈的3』端加上一個突出的鹼基A。pUCm-T載體是一種已經線性化的載體，載體每條鏈的3』端帶有一個突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT配對，在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的重組載體。
連接反應的溫度在37℃時有利於連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此採取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。 LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，可以編碼β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解．用X-Gal為底物進行染色時，呈藍色。
一些特定的質粒（比如pUC/pBS等），常帶有β—半乳糖核苷酶的調控序列和β—半乳糖核苷酶N端146個氨基酸（α肽段）的編碼序列，在這個編碼序列里還插入一個多克隆位點（MCS）,它並不影響lacZ的表達。另外，常用的大腸桿菌帶有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的編碼序列。在各自獨立的情況下，這些質粒與大腸桿菌各自編碼的β—半乳糖核苷酶片段都沒有酶的活性。只有當攜帶α肽編碼信息的克隆載體成功進入宿主細胞，在培養基誘導物IPTG的誘導下，載體質粒能夠合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），這樣就與宿主細胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互補，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而當外源基因插入到此種載體質粒lacZ的多克隆位點後，會造成lacZ基因不能表達，從而不能合成β—半乳糖核苷酶；而對於空載體，lacZ基因正常表達，通過α互補合成β—半乳糖核苷酶，分解培養基里的色素底物X-gal，最終形成藍色的化合物，出現藍色菌斑。
❸ 怎麼把一個外源dna片段從一個質粒中pcr
質粒在你插入的片段上游是有啟動子區域的,在插入的時候有時由於是單酶切或者TA克隆或者平末端克隆,你是無法確定基因插入的方向的.如果你插入序列的ATG起始密碼子是跟在啟動子後面,你就是正向插入,如果你插入序列的終止密碼子是在啟動子後面,那你就是反向插入了,這時候你插入的序列是不能夠正常表達的
❹ 如何替換質粒上十幾bp的DNA片段
如果你限定是十幾bp其實比較難進行，因為這個片段上下游必須是某一個或兩個酶切位點。但如果只是想去掉包含了這部分片段的片段，那就比較好辦啦，這段片段上下游很大的范圍內有酶切位點就行了。然後要插上目的片段的話，只要目的片段兩端插入了相應的酶切位點，這樣質粒和目的片段就可以在連接酶的作用下形成重組質粒了。而酶切位點的插入，只需在克隆片段的時候引物的5『端加上相應的酶切位點序列就好了。
❺ 蟲友們，怎樣去除細菌中頑固存在的質粒
一般方法和步驟:
確定目的基因需要整合到基因組上的位置；
設計整合片段：目的基因兩端連接與基因組上目的基因的位置兩端的序列同源，這兩個片段分別稱之為上、下同源臂，長度一般在70bp至200之間，上下同源臂之間一般除了目的基因還要帶上篩選標記基因，同源臂之間（包括同源臂）這一段序列稱為插入片段；
插入片段可以直接電轉化或者顯微注射轉化篩選，一般需要多次實驗才能成功，而且大部分細菌暫時無法電轉化和顯微注射；
不能直接轉化的，插入片段需要構建到載體質粒上（在大腸桿菌上完成），載體要帶有自殺原件或者負篩選標記，再轉化到目的菌株篩選。
❻ 重組質粒測序中的目的基因與原序列對比為什麼會碎，變成一段一段的很多小段
在同源質粒的測序中，有些是好的，說明這段序列不存在重復序列及復雜的結構！這樣的話，那些出現雙峰的質粒很可能是你在挑班搖菌時挑到了臨近的斑，導致抽到的質粒不純，或者抽質粒時很多樣品一起抽，不小心被同源質粒污染！你可以把那些雙峰的質粒稀釋後重新轉化，再小心挑單菌落抽質粒測序試一下。
❼ 如何分離質粒dna和基因組dna
分離質粒時，可以將質粒去得很乾凈。方法為：先用TE之類的試劑將菌液懸浮起來，再用NaOH和SDS將菌液裂解（起裂解作用的主要是NaOH，但此時，SDS可以與蛋白很好的結合）。第三步，加入酸中合第二步中的鹼，並且將SDS沉澱下來，同時，SDS和蛋白也一起沉澱下來，而基因組上面有很多的蛋白，這樣基因組就一起沉澱下來，上清只有質粒了。上清的質粒用乙醇沉澱，這樣得到的質粒基本沒有基因組。而分離基因組時，一般也是用SDS裂解（想對於鹼裂解，SDS比較溫和）。同時還用蛋白酶K處理，將基因組上的蛋白降解掉，這樣就得到了基因組DNA。再用乙醇沉澱，去掉其他的東東。如果菌中含有質粒，質粒也一起提出來，無法去掉。至於後來的試劑盒，如柱式，前其原理一樣，不過最後一步純度是用柱子的方法。
❽ 如何採用重疊延伸pcr刪除一段基因
採用重疊引物PCR介導的定點突變實驗是一種快速有效的在基因中特定位點引入特定突變的有效技術.該技術採用具有互補末端的引物,使PCR產物形成了重疊鏈,從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來.此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物.該技術主要包括以下幾步：設計引物,PCR擴增基因兩端,回收兩端片段,兩端片段退火延伸,擴增全長基因.
1.引物設計
重疊延伸PCR技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計.可以有三種方法來設計引物,具體如下圖所示.
引物F及R為基因兩端特異引物,其中Fm及Rm為中間引物.其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配,否則後續實驗很難成功）,突變點可以設計在Fm或Rm,也可以兩條引物上都有突變點.突變點最好是位於引物的5』端,盡量避免出現在3』端.
2.分別用引物F和Rm及Fm和R進行配對進行PCR.注意該步一定要用pfu酶,不要用Taq酶,因為Taq酶容易在PCR產物末端加A,從而可能會使產物移碼突變.
3.分別回收第2步所得兩條PCR產物（一定要用膠回收,准確回收兩條目的條帶）.
4.將第3步所得兩份PCR產物進行混合使其互為模板及引物,加入dNTP及Pfu或Taq酶進行PCR.進行PCR約5-10輪即可.
5.取第4步PCR產物做為模板,加入引物F及R進行PCR擴增出具有突變的全基因.
❾ 轉基因植物中的傳統標記基因序列要怎樣切除
目前已有4種不同的方法被用於從轉基因植物中切除標記基因：共轉化、轉座子介導的再定位、同源重組和位點專一的重組。前兩種方法是將標記基因和外源基因整合在不同的位置上，兩者在其後的植株雜交及減數分裂過程中可以被分離開。後兩種方法都是藉助於重組作用使標記基因缺失，從而切除標記基因。
1.共轉化：這一方法的原理是將標記基因和外源基因放在兩個不同的T-DNA片段內，可以是連鎖的，也可以是分別存在於不同的DNA分子上。
使用的轉化方法可以是emphasis：role=italicAgrobacteriumemphasis介導的，也可以是基因槍法。在轉化過程中兩個T-DNA片段分別被整合到植物基因組的不同位置上。在減數分裂過程中，標記基因和外源基因將被分離。這一方法所產生的共轉化後代中只有25%標記基因和外源基因被分離，因此需要從大量的轉基因植株中去篩選。另外，這一方法要求植物能進行有性生殖，不適合於馬鈴薯、甘蔗等無性繁殖植物的轉化。
而且，在使用基因槍轉化中，兩個DNA分子有時會發生共整合，不能有效地獲得切除標記基因的植物。
2.轉座子介導的再定位：這一方法是藉助於轉座子系統如玉米的AcDs、SpmdSpm的轉座作用。在轉基因植物中轉座作用可以使得帶有標記基因的DNA片段與目的基因分離。利用轉基因植物與非轉基因植物的雜交以及子代的分子分析即可以獲得無標記基因的後代植株。理論上認為，轉基因植物中只含有目的基因和轉座因子的末端重復序列，其他所有的用於轉化和轉座的DNA都被消除，如T-DNA、標記基因和轉座酶。轉座活性在各種植物中變化很大，當轉座頻率很低時需要大量的篩選工作。
3.同源重組作用：這一方法是將標記基因置於重復序列之間，通過重復序列的同源重組作用將標記基因切除。這些重復序列可以是轉基因卡盒的任何部分，如啟動子和終止信號等。在植物中同源重組發生的頻率很低，並且花費較長時間，一般需要兩輪連續的篩選，而且總的效率很低。
4.位點專一性重組：目前，至少有4種重組酶介導的位點專一的重組系統被證明在植物細胞中起作用：噬菌體P1的CRElox系統、啤酒酵母的2μm質粒FLPFRT系統、Zymosaccharomycesrouxxi的RRS系統和Mu噬菌體的Gin重組酶系統。這些方法只能用於通過有性雜交進行繁殖的植物，而且對於世代時間長的植物（如樹木）也不合適。最近，λ噬菌體的attP位點介導的專一性重組系統也被嘗試用於轉基因煙草中標記基因的消除。2個352bp的λ噬菌體的attP位點序列分別被置放於標記基因nptⅡ的兩側，通過它們之間的重組作用將標記基因去除。這一系統不需要其他蛋白的表達，也不需要遺傳分離步驟去除重組酶基因，因此可能成為去除非目的基因的有效工具，而且特別適合於無性繁殖的植物。