A. 請問細胞裂解液如何配製, 細胞裂解之後有粘滯的團塊形成,要如何避免啊
博凌科為生物科技-為你一、試劑准備1、新鮮配製冷的 RIPA 裂解緩沖液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢劑) 0.1% SDS (去垢劑)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制劑) (使用前加入)1...
B. 蛋白酶抑制劑的生化試劑
破碎細胞提取蛋白質的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質不被降解。在蛋白質提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了5種常用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質的敏感性各不相同，因此需要調整各種蛋白酶的濃度。由於蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應注意在緩沖液中加人蛋白酶抑制劑時應充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉澱。
PMSF
1）抑制絲氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);
2）10mg/ml溶於異丙醇中；
3）在室溫下可保存一年；
4）工作濃度：17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L);
5）在水液體溶液中不穩定，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF。EDTA
1）抑制金屬蛋白水解酶；
2）0.5mol/L水溶液，pH8~9;
3）溶液在4℃穩定六個月以上；
4）工作濃度：0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);
5）加入NaOH調節溶液的pH值，否則EDTA不溶解。
胃蛋白酶抑制劑（pepstantin)
l）抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶D和凝乳酶；
2）1mg/ml溶於甲醇中；
3}儲存液在4℃一周內穩定，-20℃穩定6個月；
4）1作濃度：0.7ug/ml（1umol/L)
5）在水中不溶解。
亮抑蛋白酶肽（leupeptin)
1）抑制絲氨酸和巰基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血漿酶和組織蛋白酶B;
2）lOmg/ml溶於水；
3）儲存液4℃穩定一周，-20℃穩定6個月；
4）工作濃度0.5ug/ml。
胰蛋白酶抑制劑（aprotinin)
1）抑制絲氨酸蛋白酶，如血漿酶，血管舒緩素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；
2）lOmg/ml溶於水，pH7~8
3}儲存液4℃穩定一周，-20℃穩定6個月；
4）工作濃度：0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L);
5）避免反復凍融：
6）在pH>12.8時失活。
蛋白酶抑制劑混合使用
35ug/ml PMSF………………………絲氨酸蛋白酶抑制劑
0.3mg/ml EDTA……………………金屬蛋白酶抑制劑
0.7ug/ml胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）…………酸性蛋白酶抑制劑
0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin）…………廣譜蛋白酶抑制劑
C. 請教胰酶使用注意及貼壁細胞的消化
博凌科為生物科技-為你解答：胰酶使用注意：1、在使用胰酶細胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細菌污染。2、胰酶細胞消化液消化細胞時間不宜過長，否則細胞鋪板後生長狀況會較差。貼壁細胞的消化：1、吸去培養液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清2、加入少量胰酶細胞消化液，略蓋過細胞即可，根據胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鍾（不同的細胞消化時間有所不同）3、顯微鏡下觀察，細胞明顯收縮，並且肉眼觀察培養器皿底部發現細胞的形態發生明顯的變化呈白茫狀；或者用槍吹打細胞發現細胞剛好可以被吹打下來。4、此時吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的完全細胞培養液，吹打下細胞，即可直接用於後續實驗如果發現消化不足，則加入胰酶細胞消化液重新消化。如果發現細胞消化時間過長，未及吹打細胞，細胞已經有部分直接從培養器皿底部脫落，直接用胰酶細胞培養液把細胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鍾，沉澱細胞，盡量去除胰酶細胞消化液後，加入含血清的完全培養液重新懸浮細胞，即可用於後續實驗。常用的細胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使細胞間的蛋白質（如細胞外基質）水解，改變細胞間的連接，使組織或細胞片分散成單個細胞，製成細胞懸液用於進一步的實驗。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配製條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍後存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。加入胰蛋白酶-EDTA溶液，視細胞瓶的大小加入體積為2ml或更多（依培養器皿的大小而定），以使充分浸潤；一般消化時間約為1至3分鍾，肉眼觀察瓶底由半透明（細胞單層連接成片）轉為透明、點狀（出現細小空隙）時，棄去細胞消化液，或看見培養瓶壁呈白茫 狀即可。並加入適量的完全培養液終止消化，吹打分散；如見大量細胞片狀脫落，已消化過頭，則不能頃倒消化液而直接進行下一步操作。（消化過頭，可造成大量 細胞從瓶壁上脫下，甚至造成細胞破碎。由於血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，所以加入完全培養基可以終止反應。胰酶配置方法：1、培養液配製，方便好用，對細胞影響小，並且培養液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解2、生理鹽水配製，要先調ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時，調pH 7.8-8.0，過濾除菌。）3、pbs（0.1%胰酶溶液的配製：稱取胰酶粉末0.1g，先用少許滅菌過的PBS調成糊狀，然後補足到100ml。置室溫攪拌4小時或冰箱內過 夜，過濾滅菌，分裝，4℃保存備用。）; 或是hanks或是D-hanks液配製（1.稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調成糊狀，然後再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，並不斷攪拌振盪；2.次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存備用，常用濃度為0.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調用碳酸氫鈉溶液調pH 至7.2 左右。）一般0.45微米的一次性濾器過濾除菌，至於作用效果，需要消化一次細胞感覺一下，因為不同廠家的酶不一樣，有的作用溫和，有的作用劇烈。4、是否需要四度放置過夜，取決於你的胰酶的純度。過去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要四度過夜. 而現在的胰酶純度都很高，就沒有必要四度過夜。從理論上來說，四度放置過夜，給細菌生長的機會，盡管過濾可以出去細菌，可是出不掉其代謝產物。胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因，考慮有：1、過期或是酶已經部分變性2、溶液ph值不對3、在沒過濾之前的絮狀沉澱是正常現象，因胰酶多取自動物胰腺，沉澱為組織塊，過濾後即可
D. 蛋白酶抑制劑的概述
蛋白酶是人類免疫缺陷病毒基因編碼中的一種特異天冬醯蛋白酶，其作用是將基因和基因表達所產生的蛋白裂解，成為具有活性的病毒結構蛋白和酶，是HⅣ病毒復制的關鍵物質。蛋白酶抑制劑是一種治療艾滋病的化學同類葯物。
蛋白酶抑制劑屬多肽類化合物，為抗HⅣ葯物復合療法重要組成部分，是90年代中後期的新產品，葯物合成工藝難度大，也是導致目前抗HⅣ治療費用居高不下的主要原因，被稱為必須跨越壁壘。蛋白酶抑制劑主要有：奈非那韋、沙奎邦韋、茚地那韋、安潑那韋、利托那韋、洛匹那韋及復合制劑。
E. 細胞蛋白質提取液（PBS，PMSF，蛋白酶抑制劑）各需要加多少呢
6孔板加150-250ul裂解液（含1mM PMSF），PMSF是蛋白酶抑制劑，與裂解液配比1:100
F. 提DNA用的1%SDS-PK（蛋白酶K）如何配置
50MMOL/L TRIS-CL（PH8.0）和1.5MMOL/L乙酸鈣,高壓滅菌後,該混合溶液配製成含蛋白酶K濃度為20MG/ML的溶液,將配製的蛋白酶K溶液-20度保存.
G. 0.1%鏈酶蛋白酶怎樣配置，用來做細胞培養，多謝！
一般的做法是這樣的：
把該酶的粉末溶解於含有10mmol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中，
配成為0.1%濃度，於37℃溫育1h。
分裝成小份放在密封試管中，保存-20℃。
這樣的鏈酶蛋白酶實際上是自消化過的，可以去掉其他雜質。
H. roche蛋白酶抑制劑如何使用，直接用水配加到裂解液中嗎
理論上要加的！這點是肯定的 實際上「蛋白酶抑制劑」都是劇毒品，不容易購買，不容易保管。所以我一般不加。 問題來了，「怎麼減少蛋白分解的誤差呢？」 我的做法是，將「目標組」和「對照組」在一樣的條件下，一樣的實驗點，一樣的時間點檢測。
I. 木瓜蛋白酶的作用，用法，用量，適用范圍是什麼
木瓜蛋白酶papain屬巰基蛋白酶，具有較寬的底物特異性，作用於蛋白質中L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸和L-瓜 木瓜蛋白酶氨酸殘基羧基參與形成的肽鍵。此酶屬內肽酶，能切開全蛋蛋白質分子內部肽鏈—CO—NH—生成分子量較小的多肽類。 存在於木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作為植物來源的蛋白酶來說，此酶研究進展的最快。此酶主要是以內肽酶的形態起作用。活性的產生，而半胱氨酸殘基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一種，底物的特異性不太嚴格，分子量為23400，氨基酸殘基數212。 木瓜蛋白酶是一種在酸性、中性、鹼性環境下均能分解蛋白質的蛋白酶。它的外觀為白色至淺黃色的粉末，微有吸濕性。 酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區 275nm 處有吸收峰。 木瓜蛋白酶（Papain）簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果實中的乳汁，採用現代生物工程技術提煉而成的純天然生物酶製品。它是一種含疏基(-SH)肽鏈內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、醯胺等有較強的水解能力，同時，還具有合成功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質。溶於水和甘油，水溶液無色或淡黃色，有時呈乳白色；幾乎不溶於乙醇、氯仿和乙醚等有機溶劑。最適合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性時亦有作用，等電點18.75；最適合溫度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐熱性強，在90℃時也不會完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質激活。木瓜蛋白酶在各個行業的應用1.醫葯工業應用： 含有木瓜蛋白酶的葯物，能起到抗癌、腫瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生蟲 、結核桿菌等，可消炎、利膽、止痛、助消化。治療婦科病、青光眼、骨質增生、槍刀傷口癒合、血型鑒別、昆蟲叮咬等。 2.食品工業應用： 可利用酶促反應，使食品大分子的蛋白質水解成小分子肽或氨基酸。用於水解動植物蛋白、製成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、餅干松化劑、面條穩定劑、啤酒飲料澄清劑、高級口服液、保健食品、醬油釀造及酒類發酵劑等。有效轉化蛋白質的利用，大大提高食品營養價值，降低成本。有利於人體的消化和吸收。 3.美容化妝品工業應用： 將木瓜蛋白酶加入到含有蛋白質和油脂的化妝品中，具有獨特的美白嫩膚、美顏保健、祛斑除污垢、促進血液循環、改善肌膚等功效，提高產品檔次。可製成減肥茶、美容護膚品等。 4.日化品工業應用： 用於香皂、肥皂、洗滌劑、洗衣粉、洗手液等，去污力強，除菌消毒、安全放心。 5.飼料工業應用： 用於飼料添加劑，開發蛋白源，利於吸收，提高飼料的利用率，節約成本，有助於牲畜消化，加速生長。如在豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、魚、蝦等飼料中添加。還可以作為蔬菜水果高級復合肥料的添加劑。 6.皮革工業應用： 利用木瓜蛋白酶製成脫毛劑，鞣製皮革，具有毛孔細膩，皮紋光亮效果。 紡織工業應用：可用於處理羊毛、蠶蛹脫膠、蠶絲精煉，能達到手感柔軟、舒適、抗收縮、抗張強度等效果。 7.細胞培養： 木瓜蛋白酶在准備細胞培養液（cell culture）的第一步中被用於分離細胞。用酶處理小組織塊10分鍾後，就可以將連接細胞的細胞外基質打斷；然後再用蛋白酶抑制劑來停止反應，防止木瓜蛋白酶進一步裂解細胞本身；最後用Pasteur pipette將組織塊打散為單細胞懸浮液。 8. 免疫學： 在免疫學中，木瓜蛋白酶可被用於將免疫球蛋白（即抗體）的Fc片段（可結晶）和Fab片段（抗原結合）切割開。
J. 透析時為了防止蛋白降解，一般加什麼蛋白酶抑制劑呀或者有什麼相關的建議。謝謝！
現在如果為了獲得最廣譜的抑制效果，就買抑制劑的cocktail，是將多種類型的抑制劑混合在一起，以達到最佳的抑制效果。有片劑的（Roche的用的最多）溶到溶液裡面就能用，或者是直接是高濃度溶液包裝的（Pierce的用的比較多），直接加到溶液裡面就用，可以用多少加多少，比較方便。當然，也有不加蛋白酶抑制劑的，就需要一直維持在低溫條件下進行透析。不過降解是一方面，也需要觀察透析過程中是否有蛋白由於長時間透析可能會出現蛋白沉澱的問題。