① EMSA實驗步驟
一、探針的標記
如下設置探針標記的反應體系：
（1）待標記探針 (1.75 pmol/μl) ：2μl
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1μl
（3）Nuclease-Free Water ：5μl
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1μl
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1μl
（6）總體積：10μl
（7）按照上述反應體系依次加入各種試劑，加入同位素後，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。
使用水浴或PCR儀，37℃反應10分鍾。
加入1μl 探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。
再加入89μl TE，混勻。此時可以取少量探針用於檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。
標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。
二、 探針的純化
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化後的探針會改善EMSA的電泳結果。如需純化，可以按照如下步驟操作
對於100μl 標記好的探針，加入1/4體積即25μl 的5 M醋酸銨，再加入2體積即200μl 的無水乙醇，混勻。
在-70℃至-80℃沉澱1小時，或在-20℃沉澱過夜。
在4℃，12 000 g-16 000 g離心30分鍾。小心去除上清，切不可觸及沉。
在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鍾。小心吸去殘余液體。微晾乾沉澱，但不宜過分乾燥。
加入100μl TE，完全溶解沉澱。標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在 -20℃。
三、EMSA 膠的配製
准備好倒膠的模具。可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當的模具。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便於干膠等後續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。
按照如下配方配製20毫升4％的聚丙烯醯胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1ml 重蒸水：16.2ml
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2ml
（3）80% 甘油： 625μl
（4）10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) ：150μl
（5）TEMED ：10μl
按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED後立即混勻，並馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡， 並加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理。
四、EMSA結合反應
如下設置EMSA結合反應
陰性對照反應：
（1）Nuclease-Free Water ：7μl
（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2μl
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 0μl
（4）標記好的探針 ：1μl
（5）總體積 ：10μl
樣品反應：
（1）Nuclease-Free Water ：5μl
（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2μl
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2μl
（4）標記好的探針： 1μl
（5）總體積： 10μl
探針冷競爭反應：
（1）Nuclease-Free Water ：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2μl
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 2μl
（4）未標記的探針： 1μl
（5）標記好的探針： 1μl
（6）總體積 ：10μl
突變探針的冷競爭反應：
（1）Nuclease-Free Water ：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2μl
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2μl
（4）未標記的突變探針： 1μl
（5）標記好的探針： 1μl
（6）體積 ：10μl
Super-shift反應：
（1）Nuclease-Free Water：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2μl
（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2μl
（4）目的蛋白特異抗體 ：1μl
（5）標記好的探針：1μl
（6）總體積 ：10μl
按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，並且室溫(20-25℃)放置10分鍾，從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然後加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鍾。
加入1μl EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻後立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合，建
議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對於使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液裡面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可。
五、 電泳分析
用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鍾。預電泳的時候如果有空餘的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。
把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多餘的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色)，用於觀察電泳進行的情況。
按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。
剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦乾膠板邊
緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(註：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕後(大約不足1分鍾)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
干膠儀器上乾燥EMSA膠。然後用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設備檢測。
② 凝膠遷移實驗（EMSA） 的原理及實驗方案詳解
對於新手小白做這些大實驗時可能不知所措，為了方便學習，將相關實驗進行歸納總結:
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用於定性和定量分析。這一技術最初用於研究DNA結合蛋白，已用於研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
需要兩個試劑盒 碧雲天（GS008 GS009）:一個用於生物素標記 ，一個用於凝膠遷移實驗
配備TBE緩沖液可以配置成 5× 或者 10×的儲液。
10x TBE 儲液配製方法：
將Tris（FW=121）108g，硼酸（FW=61.8）55g，40 ml 0.5 M EDTA 溶解在600 ml的去離子水中；而後調節pH至8.3，加去離子水定容至1L後，室溫保存。使用時稀釋10倍 即為1×TBE Buffer。
（1）設計重組引物TF-F，R，進行PCR擴增，PCR產物純化回收。
（2）使用NEB限制性內切酶將pet28a載體線性化，並進行純化回收。
（3）利用重組試劑盒進行重組反應(Vazyme, C112-02）。
（4）將反應體系加入DH5α感受態中，進行轉化，塗板，挑斑檢測。挑選陽性菌液過夜培養，提質粒，-20℃保存備用。
參照康為世紀試劑盒：His-tag 標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）
（1）使用1xTEN buffer溶解單鏈探針，將互補的單鏈探針按1:1混勻。
（2）95℃加熱10分鍾，自然降溫到15-25℃。
（3）取出退火探針，加入適量的1 x TEN buffer稀釋濃度至3-4pmol/ µl.。
（4）將100ng退火探針置於無酶的PCR管中，加去ddH2O補至10 µl。
（5）按以下體系將各組分混合，37℃孵育30分鍾
a. 參考上表設置反應體系。註：對於雙鏈的EMSA探針的標記反應，建議一次做兩管，即總體積共100µl，以最終獲得足夠的生物素標記EMSA探針用於後續EMSA檢測。
b. 用槍輕輕吹打混勻，切勿vortex。37ºC孵育30分鍾。
c. 加入2.5µl 探針標記終止液，輕輕混勻終止反應。
a. 探針標記反應終止後，加入52.5µl氯仿-異戊醇(24:1)，vortex使有機相和水相充分混合以抽提TdT(說明：靜止後有機相和水相會很快分層)。
b. 12000-14000g離心1-2分鍾。吸取上清備用。上清即為被生物素標記的單鏈DNA探針。
通常為實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。有些時候，純化後的探針會改善後續實驗的結果。如需純化，可以按照如下步驟操作：
a. 對於100µl標記好的探針，加入1/4體積即25µl的5M醋酸銨，再加入2體積即200µl的無水乙醇，混勻。
b. -70ºC至-80ºC沉澱1小時，或-20ºC沉澱過夜。
c. 4ºC，12,000g-16,000g離心30分鍾。小心去除上清，切不可觸及沉澱。
d. 4ºC，12,000g-16,000g離心1分鍾。小心吸去殘余液體。微晾乾沉澱，但不宜過分乾燥。 e. 加入50µl TE，完全溶解沉澱。標記好的探針可以-20ºC保存。
a. 取5µl Biotin-Control Oligo (0.4µM)，加入196µl TE，混勻，稀釋成10nM Biotin-Control Oligo(作為標准品)。取出適量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
b. 取3µl步驟3B所獲得的生物素標記的DNA探針(100nM)，加入27µl TE，混勻，稀釋成10nM 生物素標記的探針(作為待測樣品)。取出適量的10nM 生物素標記的探針，依次稀釋成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
c. 參考下面的表格，取一適當大小的帶正電荷尼龍膜，在膜上做好相應標記。對於經過梯度稀釋的標准品和待測樣品，分別取2µl滴加到膜上。在膜上滴加標准品或待測樣品時，請注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一個濕的圓形小斑點。說明：如果條件許可，可以使用專門用於點雜交或狹縫雜交的設備進行探針標記效率的檢測，探針的用量參考下表，濃度可以再稀釋50倍，而所用體積可以相應放大50倍至100µl。
a. 對於步驟2B標記好的單鏈DNA探針，把正義鏈和反義鏈等體積混合(不可根據標記效率調整摩爾比例)。對於最初使用變性的雙鏈EMSA探針進行探針標記的情況，直接進入下一步。
b. 加入退火緩沖液(10X)，使退火緩沖液的最終濃度為1X，混勻。例如待退火探針的體積為100微升，則加入11微升退火緩沖液(10X)。
c. 如下設置PCR儀進行退火反應：
注1：如果所用的PCR儀不具備下降0.1ºC的功能，也可以設置為每90秒下降1ºC。
d. 退火反應結束後，-20ºC保存標記好的EMSA探針。此時的EMSA探針已經可以直接用於後續的EMSA檢測，也可以對探針進行適當純化後再進行EMSA檢測。
a. 准備好倒膠的模具。可以使用常規的制備蛋白電泳膠的模具(例如BioRad的常規用於蛋白電泳的制膠裝置)，或其它適當的模具。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便於干膠等後續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。制膠前必須把制膠模具沖洗干凈，需特別注意不能有SDS殘留。
b. 按照如下配方配製20ml 4%的聚丙烯醯胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。
注意：此實驗中需去除SDS變性劑
c. 按照上述順序依次加入各種試劑，加入TEMED前先混勻，加入TEMED後立即混勻，並馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡，並加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理
b. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，並且室溫(20-25ºC)放置10分鍾，從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然後加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25ºC)放置20分鍾。
c. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻後立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對於使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液裡面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至可以觀察到藍顏色即可。
a. 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鍾。預電泳的時候如果有空餘的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。
b. 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多餘的某個上樣孔內加入10µl稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍色)，用於觀察電泳進行的情況。
c. 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30ºC，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。
a. 取一和EMSA膠大小相近或略大的尼龍膜，剪角做好標記，用0.5XTBE浸泡至少10分鍾。尼龍膜自始至終僅能使用鑷子夾取，並且僅可夾取不可能接觸樣品的邊角處。
b. 取兩片和尼龍膜大小相近或略大的濾紙，用0.5XTBE浸濕。
c. 把浸泡過的尼龍膜放置在一片浸濕的濾紙上，注意避免尼龍膜和濾紙間產生氣泡。
d. 非常小心地取出EMSA膠放置到尼龍膜上，注意確保膠和膜之間沒有氣泡。
e. 再把另外一片浸濕的濾紙放置到EMSA膠上，注意確保濾紙和膠之間沒有氣泡。 碧雲天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 GS009 化學發光法EMSA試劑盒 3 / 5
f. 採用Western時所使用的濕法電轉膜裝置或其它類似的電轉膜裝置，以0.5XTBE為轉膜液，把EMSA膠上的探針、蛋白以及探針和蛋白的復合物等轉移到尼龍膜上。對於大小約為10x8x0.1cm的EMSA膠，用BioRad的常用的Western轉膜裝置，電轉時可以設置為380mA(約100V)轉膜30-60分鍾。如果膠較厚，則需適當延長轉膜時間。轉膜時需保持轉膜液的溫度較低，通常可以把電轉槽置於4ºC冷庫或置於冰浴或冰水浴中進行電轉，這樣可以確保低溫。具體的電轉膜方法請參考電轉膜裝置的使用說明。
g. 轉膜完畢後，小心取出尼龍膜，樣品面向上，放置在一乾燥的濾紙上，輕輕吸掉下表面明顯的液體。立即進入下一步的交聯步驟，不可使膜幹掉。
a. 用紫外交聯儀(UV-light cross-linker)選擇254nm紫外波長，120mJ/cm2，交聯45-60秒(根據經驗，建議交聯30min)。如果沒有紫外交聯儀可以使用普通的手提式紫外燈(例如碧雲天的手提紫外檢測儀(EUV002))，距離膜5-10厘米左右照射3-10分鍾。也可以使用超凈工作台內的紫外燈，距離膜5-10厘米左右照射3-15分鍾。最佳的交聯時間可以使用標准品自行摸索。
b. 交聯完畢後，可以直接進入下一步檢測；也可以用保鮮膜包裹後在室溫乾燥處存放3-5天，然後再進入下一步檢測。
c. 如果檢測結果發現交聯效果不佳，甚至連free probe的條帶都非常微弱，可以考慮在膜乾燥後參考步驟A的條件再交聯一次，以進一步改善交聯效果。
a. 37-50ºC水浴溶解封閉液和洗滌液。 注意：封閉液和洗滌液必須完全溶解後方可使用，封閉液和洗滌液可以在室溫至50ºC之間使用，但必須確保這兩種溶液中均無沉澱產生，在冬天需特別注意。
b. 取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯過的含有樣品的尼龍膜。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鍾。
c. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:2000稀釋)，混勻備用。
d. 去除用於尼龍膜封閉的封閉液，加入上一步中配製的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動15分鍾。
e. 取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q級純水，混勻配製成125ml洗滌液。
f. 將尼龍膜轉移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內，漂洗1分鍾。
g. 去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鍾。
h. 重復步驟G 三次(共洗滌四次)，每次洗滌時間都約為5分鍾。
i. 將尼龍膜轉移至另一裝有20-25ml檢測平衡液的容器內，在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動5分鍾。
j. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混勻，配製成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必須現配現用。說明：從本步驟起操作方法和注意事項同Western實驗的熒光檢測。
k. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處於水平桌面上的潔凈容器內或保鮮膜上。
l. 在尼龍膜的表面小心加上步驟J配製好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鍾。
m. 取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當的透光薄膜中間，並固定於壓片暗盒(也稱片夾)內。
n. 用X光片壓片1-5分鍾。可以先壓片1分鍾，立即顯影定影，然後根據結果再調整壓片時間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鍾或更長時間，然後一起顯影定影觀察結果。